Ključna razmatranja dizajna za protokole ispitivanja validacije klirensa virusa proizvoda za gensku terapiju

ICH Q5A(R2)-International Harmonization Foundation

ICH Q5A(R2) službeno je usvojen 1. studenog 2023. i predstavlja temeljni međunarodni dokument sa smjernicama za procjenu virusne sigurnosti. U usporedbi s Q5A(R1) objavljenim 1999., značajna ažuriranja u verziji R2 uključuju: novo dodano poglavlje o procjeni virusne sigurnosti u kontinuiranoj proizvodnji (poglavlje 7); pojačana uloga procjene rizika kao temelja strategija uklanjanja virusa; uključivanje sljedeće{10}}generacije sekvenciranja (NGS) u razmatranja otkrivanja virusa; i eksplicitne zahtjeve za ocjenu novih proizvoda i proizvodnih procesa. Q5A(R2) usvojila su regulatorna tijela uključujući FDA, EMA i PMDA, pružajući objedinjeni tehnički okvir za validaciju uklanjanja virusa širom svijeta.

NMPA-Kineski regulatorni sustav

NMPA regulatorni okvir za virusnu sigurnost pokriva više razina:

Razina dokumenta	Naziv dokumenta	Godina izdanja
Temeljni dokument	Tehničke smjernice za uklanjanje/deaktivaciju virusa iz krvnih pripravaka	2002
Temeljni dokument	Opća načela za tehnički pregled evaluacije virusne sigurnosti bioloških tkiva-izvedenih proizvoda i eukariotskih stanica-izraženih proizvoda	2005
Smjernice za-specifične proizvode	Tehničke smjernice za farmaceutska istraživanja i evaluaciju kliničkih ispitivanja za rekombinantne vektore povezane s adeno-virusom (rAAV)-temeljene na in vivo proizvodima za gensku terapiju	2023
Smjernice za-specifične proizvode	Uobičajeni tehnički zahtjevi za farmaceutsku kvalitetu vektora rekombinantnog adeno-povezanog virusa (rAAV)-temeljenih in vivo proizvoda za gensku terapiju za prijave za stavljanje u promet	2025
Inovativna smjernica	Tehničke smjernice za validaciju platforme procesa uklanjanja virusa za kliničke studije primjene terapijskih rekombinantnih proteinskih proizvoda (ispitivanje)a	2024

a: Ova smjernica predstavlja prvi put da je kinesko regulatorno tijelo postavilo sustavne tehničke zahtjeve za validaciju platforme procesa uklanjanja virusa i usklađeno je s duhom ICH Q5A(R2).

FDA i EMA-Regulatorni zahtjevi SAD-a i Europe

FDA je službeno izdala dokument sa smjernicama za industriju temeljen na ICH Q5A(R2) u siječnju 2024. Osim toga, poglavlje Farmakopeje Sjedinjenih Država (USP)<1050.1>pruža dodatne tehničke smjernice o dizajnu, evaluaciji i karakterizaciji postupaka uklanjanja virusa. FDA svake dvije godine organizira simpozij o uklanjanju virusa; simpozij 2023. bavio se najnovijim-temama kao što su novi modaliteti, kontinuirana proizvodnja, novi mediji za kromatografiju i adsorpcijski filtri. Temeljni dokumenti sa smjernicama EMA-e uključuju CPMP/BWP/268/95 (Napomena za smjernice o studijama provjere valjanosti virusa: dizajn, doprinos i tumačenje studija koje potvrđuju inaktivaciju i uklanjanje virusa) i EMEA/CHMP/BWP/398498/2005 (Smjernice o procjeni sigurnosti virusa u biotehnološkim istraživanjima Medicinski proizvodi), a oba su usklađena s ICH Q5A(R2).

Identifikacija izvora virusne kontaminacije

ICH Q5A(R2) naglašava da se dizajn validacije uklanjanja virusa treba temeljiti na sveobuhvatnoj procjeni rizika. Za proizvode genske terapije, identifikacija izvora virusne kontaminacije trebala bi se odnositi na sljedeće razine:

Razina stanične banke: endogeni virusi (npr. retrovirusne čestice) i latentno infektivni virusi koji se potencijalno nalaze u supstratima stanica za proizvodnju (npr. HEK293, CHO, HeLa). Poznato je da stanice HEK293 sadrže endogene sekvence Ad5 E1 i fragment EBV od približno 900 bp te su sposobne eksprimirati replikaciju-kompetentnog adenovirusa; stoga ovom riziku treba posvetiti posebnu pozornost u procjeni rizika.

Razina pomoćnog virusa: proizvodnja vektora AAV obično koristi metode kao što je trostruka transfekcija pomoću pomoćnih plazmida, koji nose rizik od stvaranja replikaci-kompetentnog adenovirusa (RCA). Slično, stanice za pakiranje koje se koriste u proizvodnji lentivirusnog vektora mogu generirati replikacijski-kompetentni lentivirus (RCL).

Razina sirovina: Slučajni virusi mogu se unijeti kroz sirovine koje se koriste u proizvodnji, uključujući medije za kulturu stanica, hranu za životinje i enzime. Ovaj rizik je posebno značajan kada se koriste komponente životinjskog-podrijetla (npr. fetalni goveđi serum, otopine za probavu tripsina).

Razlike u riziku: Genska terapija naspram tradicionalnih rekombinantnih proteina

Dimenzija rizika	Tradicionalni rekombinantni proteinski proizvodi	Proizvodi za gensku terapiju
Viralni izvor	Endogeni virusi iz stanične banke; adventivni virusi	Virusi staničnih banaka; pomoćni virusi; replikacijski-kompetentni vektori (RCV/RCL); integracija genoma domaćina
Stanični supstrat	CHO, NS0, Sp2/0 i druge dobro-karakterizirane stanične linije	HEK293, HeLa, CHO, itd.; neke stanične linije su tumorogenog podrijetla
Karakteristike proizvoda	Lijek na bazi proteina-; dobro-definirana struktura	virusni vektor; predstavlja rizike za biološku sigurnost
Strategija provjere valjanosti	Više{0}}koračno uklanjanje virusa; naglasak na validaciji koraka procesa	Potrebno otkrivanje RCV/RCL; provjera valjanosti i testiranje bitna
Validacija platforme	Primjenjivo na utvrđene procese kao što su S/D, niski pH, nanofiltracija	Ograničena primjenjivost zbog raznolikosti tipova vektora

Tablica 1. Usporedba sigurnosnih rizika od virusa: proizvodi za gensku terapiju u odnosu na tradicionalne rekombinantne proteinske proizvode

Opća načela

Odabir virusa indikatora središnji je element u dizajnu protokola za validaciju uklanjanja virusa. ICH Q5A(R2) zahtijeva da se odabir indikatorskog virusa temelji na procjeni rizika i da se uzmu u obzir sljedeći čimbenici:

Relevantnost virusa za supstrat proizvodne stanice (relevantni virus)

Fizikalno-kemijska svojstva virusa (s ovojnicom/bez{0}} ovojnice, DNA/RNA, raspon veličina)

Otpornost virusa na fizičke/kemijske tretmane

Detektabilnost i biološka sigurnost virusa

Za proizvode genske terapije odabir indikatorskog virusa mora dodatno uzeti u obzir: ulogu samog vektorskog virusa kao "relevantnog virusa"; potencijalni rizik od kontaminacije pomoćnim virusom; i zahtjevi za otkrivanje i provjeru valjanosti virusa-sposobnih za replikaciju (RCV/RCL).

Preporučena ploča indikatora virusa

Virus	Tip	Omotnica	Genom	Veličina (nm)	Obrazloženje odabira / Primjena
MVM	Parvovirus	Nijedan	ssDNA	18–26	Model bez{0}}kuverte; najmanja veličina i najveći otpor; prikladno za validaciju nanofiltracije (općenito nije primjenjivo za rAAV vektorske proizvode)
PPV	Parvovirus	Nijedan	ssDNA	18–26	Model bez{0}}kuverte; često korišten indikatorski virus za krvne produkte
Reo-3	Reovirus	Nijedan	dsRNA	60–80	Model bez{0}}kuverte; srednje veličine; visoka fizička stabilnost
PRV	Herpesviridae	Da	dsDNA	150–200	Model s omotnicom; velika veličina; širok raspon domaćina
X-MuLV	Retrovirus	Da	ssRNA	80–110	Model retrovirusa s ovojnicom; prikladno za CHO-izvedene stanične supstrate
BVDV	Flaviviridae	Da	ssRNA	40–60	Model s omotnicom; koristi se za procjenu metoda kemijske inaktivacije (HCV surogat)
VSV	Rhabdoviridae	Da	ssRNA	70	Model s omotnicom; široka tolerancija na pH; pogodan za provjeru inaktivacije niskog-pH

Tablica 2. Preporučena ploča pokazatelja virusa za provjeru klirensa virusa proizvoda za gensku terapiju

Posebna razmatranja za AAV Vector proizvode

Za rekombinantne AAV vektorske proizvode, NMPA Tehničke smjernice za farmaceutska istraživanja i evaluaciju kliničkih ispitivanja za proizvode za gensku terapiju in vivo-temeljene na rAAV vektoru zahtijevaju da se obrati pozornost na otkrivanje replikacije-kompetentnog AAV (rcAAV). rcAAV se odnosi na AAV sposoban za autonomnu replikaciju, koja obično proizlazi iz homologne rekombinacije između pomoćnog plazmida i produkta AAV genoma. Detekcija rcAAV općenito se provodi pomoću infektivnih testova ili qPCR metoda, koje se provode odvojeno na ljekovitoj tvari i pročišćenom proizvodu.

Vrijedno je napomenuti da nizvodni procesi pročišćavanja za proizvode AAV vektora obično uključuju digestiju nukleazom, kromatografiju (AEX), nanofiltraciju i kromatografiju ionske izmjene (CEX/IEX). U tradicionalnoj validaciji uklanjanja virusa, ovi koraci procesa mogu dovesti do značajnih gubitaka samog vektora AAV; stoga se interakcija između vektorskih i indikatorskih virusa mora pažljivo razmotriti tijekom-dizajna smanjenog modela. Za određene korake procesa (npr. nanofiltracija) gdje su gubici AAV vektora znatni, treba procijeniti jesu li prilagodbe procesa opravdane na temelju validacijskih podataka (npr. prilagodba veličine pora nanofiltracijske membrane).

Opća načela

Smanjeni -model (SDM) temeljni je alat za validaciju uklanjanja virusa; njegov dizajn mora točno predstavljati učinak uklanjanja virusa u procesu proizvodnje. ICH Q5A(R2), odjeljak 6.2.2, izričito zahtijeva da smanjeni-model održava dosljednost s proizvodnim procesom u ključnim parametrima. Za proizvode genske terapije, sljedeća su razmatranja posebno važna u dizajnu SDM-a:

Reprezentativnost kritičnih procesnih parametara

Smanjeni-model trebao bi biti u skladu s procesom proizvodnje u sljedećim parametrima: kromatografski uvjeti (sastav pufera, pH, vodljivost); omjer punjenja (omjer mase vektora/supernatanta proteina); vrijeme kontakta i temperatura; brzina protoka/vrijeme zadržavanja; čistoća i sastav proizvoda. Za AAV proizvode, učinak vektorske distribucije veličine čestica i praznog sadržaja kapside na performanse nanofiltracije također bi se trebao posebno pozabaviti.

Zahtjevi za kvalifikaciju modela

ICH Q5A(R2) zahtijeva odgovarajuću kvalifikaciju smanjenog -modela, uključujući: usporedbu atributa kvalitete proizvoda (npr. čistoća, oporavak, gustoća); kvalifikacija dosljednosti kritičnih parametara procesa; i osiguravanje -smanjenog modela koji bilježi varijabilnost procesa proizvodnje. Za korake kromatografije treba kvalificirati konzistentnost profila vrha, eluacije i ispiranja; za korake nanofiltracije treba provjeriti učinke volumnog kapaciteta i sastava proizvoda.

Formula izračuna LRV

Log redukcijska vrijednost (LRV) temeljna je metrika za mjerenje učinkovitosti uklanjanja virusa. ICH Q5A(R2), Odjeljak 6.5, daje detaljan opis metoda izračuna LRV i statističke obrade. Osnovna formula za izračun LRV je: LRV=log₁₀(N₀/N), gdje je N₀ početni titar virusa nakon dodavanja virusa, a N je rezidualni titar virusa nakon procesne obrade. Kada rezidualni titar virusa padne ispod granice detekcije testa, treba koristiti metode procjene kao što je Poissonova distribucija (npr. testiranje velikog-volumena).

Primjena intervala povjerenja

I ICH Q5A(R2) i EMA CPMP/BWP/268/95 zahtijevaju procjenu intervala pouzdanosti rezultata izračuna LRV. Obično se primjenjuje interval pouzdanosti od 95%.

Kriteriji za učinkovitost

Prema tehničkim smjernicama NMPA za uklanjanje/deaktivaciju virusa iz krvnih proizvoda, smanjenje virusa veće od ili jednako 4 loga pokazuje da je korak postupka učinkovit za uklanjanje/deaktivaciju virusa. Međutim, ovaj kriterij nije apsolutni prag i treba ga procijeniti na holistički način zajedno s krivuljama kinetike inaktivacije, znanstvenim obrazloženjem za odabir virusa indikatora i cjelokupnom ispravnošću dizajna validacijskog protokola. Za proizvode za gensku terapiju posebnu pozornost treba posvetiti kumulativnom kapacitetu uklanjanja u svim koracima procesa kako bi se osiguralo da je ukupni virusni sigurnosni profil na prihvatljivoj razini.

Primjena i izazovi nanofiltracije

Virus{0}}retencijska filtracija (nanofiltracija) kritičan je korak uklanjanja virusa u daljnjem pročišćavanju proizvoda genske terapije. Tipični filtri-za zadržavanje virusa imaju veličinu pora od približno 20 nm. Mehanizam uklanjanja virusa nanofiltracije prvenstveno se temelji na isključivanju -temeljenog na veličini i može učinkovito ukloniti većinu virusa većih od veličine pora membrane, uključujući male parvoviruse bez -omotače kao što su MVM i PPV.

Međutim, nanofiltracija za proizvode genske terapije suočava se s jedinstvenim izazovima: veličina AAV vektora (približno 20-26 nm) slična je onoj kod određenih indikatorskih virusa (npr. MVM, 18-26 nm), što može rezultirati smanjenim oporavkom vektora; prazne kapside mogu utjecati na protok filtracije i učinkovitost zadržavanja virusa; viskoznost uzorka može značajno porasti s koncentracijom vektora. Stoga bi dizajn SDM-a za validaciju nanofiltracije trebao u potpunosti uzeti u obzir učinke vektorske distribucije veličine čestica i sadržaja praznih kapsida na performanse filtracije, a trebalo bi razmotriti korištenje nanofiltracijskih membrana s većim veličinama pora prema potrebi.

Procjena klirensa virusa kromatografskih koraka

Kromatografija ionske izmjene (IEX) ključni je korak u postupcima pročišćavanja proizvoda AAV, koji obično koristi digestiju nukleazom nakon koje slijedi kromatografija anionske izmjene (AEX) za hvatanje praznih i neispravnih kapsida ili kromatografija kationske izmjene (CEX) za fino pročišćavanje punih kapsida. Mehanizmi čišćenja virusa u kromatografskim koracima uključuju isključivanje veličine, elektrostatske interakcije, interakcije afiniteta i druge čimbenike. Rasprave na simpoziju FDA 2023 Viral Clearance Symposium istaknule su da učinkovitost kromatografskih koraka u uklanjanju virusa ovisi o više čimbenika, uključujući kapacitet punjenja, pH, vodljivost i kruženje smole; za sveobuhvatnu procjenu treba usvojiti-višefaktorski ortogonalni pristup dizajnu.

Kontrola virusne sigurnosti u kontinuiranoj proizvodnji

Novododano Poglavlje 7 ICH Q5A(R2) postavlja posebne zahtjeve za procjenu virusne sigurnosti u kontinuiranoj proizvodnji. Za proizvode za gensku terapiju, kontinuirana proizvodnja postala je važan razvojni smjer, ali također uvodi nove izazove virusne sigurnosti. Strategije kontrole virusne sigurnosti u kontinuiranoj proizvodnji uključuju:-linijske filtre za zaštitu od virusa kao kritične mjere zadržavanja; odgovarajući dizajn vremena zadržavanja i tokova procesa; uključivanje koraka inaktivacije s definiranim vremenima zadržavanja; i poboljšanu primjenu procesne analitičke tehnologije (PAT) za-praćenje kritičnih parametara procesa u stvarnom vremenu.